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分析方法验证可接受标准深度剖析—线性篇

时间:2019-10-05 来源:西酱记

本文通过对分析方法验证中的线性可接受标准进行深度剖析,以便大家理解各指导原则或指南所推荐的相关要求。只有透过现象看本质,不拘泥于指南要求,才能制定符合其既定用途的可接受标准,如线性相关系数可接受标准制定为不小于0.99还是不小于0.999;有关物质的线性截距制定为不得过25%,是否可以满足测定要求;剩余标准偏差有没有必要统计。


1.分析方法验证线性概述


线性系指在设计的范围内,测定响应值与试样中被测物浓度呈比例关系的程度。2015版《中国药典》通则<9101>中规定应列出回归方程、相关系数和线性图。USP<1225>规定应提交其相关系数、Y轴截距、回归线斜率、残留平方和。2010版实验室控制系统GMP实施指南要求,需统计相关系数、截距、剩余标准偏差。


2.名词解释


相关系数(R):相关系数是解释变量与总变异之比,也可以说成是y的样本变异中被x解释的部分,占比越大解释的就越多。


 假设总平方和SST不为零(除非所有y都相等这样一个极端的情况),可以得到相关系数:

 

SSE:解释平方和、SST:总平方和、SSR:残差平方和、R2线性相关系数。


残留平方和(SSR):为了明确解释变量和随机误差各产生的效应是多少,统计学上把数据点与它在回归线上相应位置的差异称残差,把每个残差的平方和称为残差平方和,它表示随机误差的效应。


截距:一般是指在Y轴上的截距,即直线和Y轴的交点纵坐标。


剩余标准偏差(SE):也称均方差,统计学概念,在线性回归分析中,真实值和估计值之间的差成为残差(或者剩余量),所有预测值的残差平方和(或者剩余平方和),剩余标准偏差就是剩余平方和的开平方,用来表示估计值的精度。EXCEL表中可采用STEYX进行计算。


3.线性相关系数的意义及控制方式


线性通过最小二乘法进行曲线拟合,其相关系数是评估一元回归线是否有意义,通常用R表示。

计算公式为

1、当所有的Yi值都在回归线上时,R=1


2、当y与x之间不存在直线关系时,R=0


3、当R的绝对值在0与1之间时,可根据测量的次数及置信水平与相应的相关系数临界值比较,绝对值大于临界值时,则认可这种线性关系是有意义的。


相关系数的临界值表(部分)

若测定次数为5,则f=5-2=3,R≥ 0.991说明该线性的置信度为99.9%。


举例:若R为0.990,说明变量Y的变异中有99.0%是由变量x引起的,该参数属于是概率评估。


实际上只要满足n=5,R≥ 0.991则线性的置信度(99.9%)完全满足线性相关性要求。若非要体现不同方法的差异性控制。可按下述思路考虑:


目前线性均是采用对照品储备液逐级稀释进行,线性相关性主要取决于:


1、测定原理;


2、检测过程偏差(样品的配制过程产生的偏差及仪器的进样精度);


3、质量标准中的限度要求。


基于以上三点,线性相关系数可按下表制定可接受标准:


案例01-1

案例01-2

4.线性截距的意义及控制方式


以杂质线性截距为例进行说明。


化药杂质控制一般采用外标一点法进行,即默认线性通过原点,需评估线性偏离对测定结果的影响,Y轴截距的绝对值应在标准响应值的25%以内。


为什么是25%?


USP<621>system suitability-271页计算公式是对含量测定范围与系统适用性相关要求进行说明,相关要求不适用于有关物质控制。


但“RSD”与“限度范围要求”的相关性的计算公式,我们可以引申一下,RSD%=KB ꇌn/t90%,n-1,RSD为相对标准偏差,K为常数0.349,B为各论中给出的上限减去100%(引申为含量的范围要求),n为参考溶液重复进样的次数(3 ≤n ≤6),t90%是在n-1自由度90%的概率下的一组t值。


相对标准偏差要求

根据公式,若B为30%(即杂质回收率范围为70%-130%),则进样6次允许的最大RSD为12.7%。假设线性从限度浓度50%做到150%且50%、150%的点相对均值的波动幅度为12.7%,则Y轴截距的绝对值约为100%响应值的25%。如下所示:

案例02:截距在20%-25%之间,回收率范围对应为70%-130%


线性截距可接受标准的制定:

5. 线性剩余标准偏差的意义及控制方式


线性的剩余标准偏差也称均方差,统计学概念,在线性回归分析中,真实值和估计值之间的差成为残差(或者剩余量),所有预测值的残差平方和(或者剩余平方和),剩余标准偏差就是剩余平方和的开平方,用来表示估计值的精度。EXCEL表中可采用STEYX进行计算,该参数统计的意义:


每一个样品浓度x对应有一个y值,根据正态分布原理,y=a+bx线性方程,其中:


68.3%置信区间为y=a+bx±SE

95.4%置信区间为y=a+bx±2SE

99.7%置信区间为y= a+bx±3SE


案例 03

 

 

6.关于线性响应因子的标准偏差及控制方式


该指标用于评估测定系统偏差(人员及设备引入),以RSD表示:


案例04

 

7.关于线性是进单针还是双针


若是手动进样,为减少进样差异,一般进双针(取均值进行线性统计),现在均是自动进样,进样精度大大提高,故单样单针即可。

 

 

参照文献

[1]《中国药典》通则<9101>

[2]USP<1225>

[3]USP<621>

[4]2010版实验室控制系统GMP实施指南

 

排版:文竹


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